4.1 SECUENCIAS HOMÓLOGAS A amyM DE BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS


En la búsqueda de homología de nuestra proteína hemos obtenido proteínas homólogas en distintas ramas filogenéticos (Bacillus, Thermococcus, Zea maiz, Drosophila o humano), aunque los organismos más cercanos filogenéticamente son los que presentan mayor porcentaje de identidad.

4.2. MATRICES DE PUNTOS


A partir de la realización de las matrices de puntos con las secuencias nucleótídicas 5' no codificante (los promotores), podemos concluir que en estas matrices se observa cual es el organismo más alejado filogenéticamente del organismo de la secuencia de referencia, que en este caso se trata de Drosophila melanogaster. Esta conclusión la tomamos porque en esta matriz poseen menos diagonales que las otras matrices, indicando así menores regiones de similitud en los promotores.

Las secuencias no codificantes de los genomas esconden señales de secuencia que pueden tener funciones fundamentales, por ello analizamos las diagonales con una longitud intermedia de la matriz que compara la secuencia de referencia con la secuencia del organismo más alejadao filogenéticamente, ya que si encontramos zonas de unión a factores de transcripción conservadas en este organismo, se tratará de un factor de transcripción muy importante para nuestro gen amyM. Tras los resultados obtenidos podemos concluir que debido a la pequeña longitud de estas secuencias y a la baja puntuación obtenida, los resultados pueden ser obtenidos por azar. Se podrían hacer alineamientos múltiples de secuencias de múltiples organismos para obtener resultados positivos y significativos.

4.3 ALINEAMIENTO MÚLTIPLE Y FILOGENIA


El estudio del alineamiento múltiple proteico nos proporciona información de los aminoácidos del sitio activo, de los aminoácidos que participan en la unión a metales y la conservación de los dominios. Los residuos que conforman el sitio activo son aminoácidos que se conservan a lo largo de la evolución y deben presentar características hidrofílicas y carga negativa como el ácido glutámico (E) y el ácido aspártico (D). Los residuos de unión a metales están menos conservados, esto puede ser porque su función es de menor importancia, en comparación con los aminoácidos del sitio activo ya que en algunos casos el residuo no se conserva o bien varía en función de un tipo u otro de aminoácido. No obstante, en la mayoría de los casos estos aminoácidos presentan una propiedad electrostática común tanto la asparragina (N), el ácido aspártico (D), la histidina (H), el ácido glutámico (E) y como la serina (S) son aminoácidos hidrofílicos con lo cual afirmamos que esta característica es esencial para la unión del ión calcio en la proteína tanto en la de referencia como en las proteínas homólogas analizadas. Con respecto a la conservación de los dominios observamos como desde el aminoácido 34 ( extermo 5') hasta la mitad de las secuencia proteíca existe grandes regiones conservadas. Esta particularidad tiene sentido puesto que es en esta región donde se encuentra el dominio alpha amilasa de la proteína.
Sin embargo, el alineamiento múltiple de las secuencias de nucleótidos codificantes (CDS) generado no aporta información posicional a diferencia del análisis del alineamiento múltiple de las secuencias de aminoácidos.

Según la información aportada por los árboles filogenéticos generados al realizar el alineamiento múltiple tanto proteíco y CDS, los microorganismos pertenecientes a los géneros Bacillus /Paenibacillus se agrupan en ramas distintas a los microorganismos pertenecientes a los géneros Thermococcus/Thermofilum aunque estas ramas están estrechamente relacionadas debido a la cercanía evolutiva.



4.4 BÚSQUEDA DE DOMINIOS Y MOTIVOS


Gracias a la base de datos Pfam, hemos encontrado que nuestra proteína está compuesta por 4 dominios.
Analizando su dominio más importante (alpha-amylase) hemos comprobado que existen numerosos aminoácidos conservados para la familia de proteínas, y hemos comparado estos resultados con el del alineamiento múltiple con CrustalX observando importantes coincidencias entre ambos.
Los aminoácidos más importantes debido a su conservación (observando el HMM logo), son aquellos que presentan un papel muy importante para la estructura (interacción entre diferentes aminoácidos) o que intervienen en su función (partes del centro activo).
La comparación de los árboles filogenéticos realizados anteriormente con los obtenidos en Pfam no fue posible, debido a la enorme cantidad de especies que los componían.
Por último, con la base de datos PROSITE pudimos comprobar los resultados anteriores y con InterPro, observamos también la existencia de los sitios activos que aparecían en la ficha Uniprot de la proteína.


4.5. PREDICCIÓN DE ESTRUCTURA


El estudio estructural de la proteína nos ha ofrecido información sobre la disposición de los aminoácidos del centro activo comprobando como dos aminoácidos se encuentran cercanos mientras que el otro permanece alejado. Otra de las conclusiones que podemos extrapolar del estudio estructural es que la topología de la proteína es TIM barrel, es decir, ocho alfa hélice y ocho beta-laminas alternadas a lo largo del esqueleto proteíco.

Bien, pero bastaba con puntualizar conclusiones, sin describir metodologías, ni justificar.

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